PNAS | 张君秋等课题组揭示DNA错配修复蛋白促进复制叉不稳定

撰文︱张君秋责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇

DNA错配修复（mismatch repair，MMR）是一个复制相关的DNA修复机制，其在复制过程中起到多种作用[1, 2]。经典的MMR负责修复从DNA聚合酶校对作用逃逸的复制错误，是维持基因组稳定性的重要一环[3, 4]。虽然与复制连接紧密，长久以来，DNA错配修复与DNA复制是如何协作的一直是一个悬而未决的难题。

人类MMR由MutSα（MSH2-MSH6）、MutLα（MLH1-PMS2）、PCNA（proliferating cell nuclear antigen）、RPA（replication protein A）、exonuclease 1（Exo1）、RFC（replication factor C）和 Polδ [5]完成。其中的很多分子都同时参与DNA复制，因此MMR需要与DNA复制协作才能使得复制错误在核小体装配（nucleosome assembly）之前完成。PCNA在核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）中抑制DNA复制以赋予修复充分的时间[6, 7]。同样的机制可能作用于MMR和DNA复制。

近日，德克萨斯大学西南医学中心Guo-Min Li课题组张君秋博士在学术期刊PNAS上发表了题为“The mismatch recognition protein MutSα promotes nascent strand degradation at stalled replication fork”的研究。该研究试图探索DNA错配修复系统是否可以调控DNA复制速度，研究者发现在聚合酶校对亚基286号位脯氨酸到精氨酸突变的高突变型Polε小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，较多的MMR蛋白富集并没有降低复制的速度，此外，在复制压力下MMR识别蛋白MutSα的富集促进停滞复制叉的降解。

作者首先发现，P286R突变造成细胞产生大量的复制错误，是正常细胞的120倍（图1a）。MMR系统识别出了这些复制错误，并及时富集到错配所在基因组位置。荧光共聚焦显微镜显示明显加强的MSH2蛋白的染色体富集，并且信号不会被CSK缓冲液预处理减弱，表明是紧密结合的染色体募集。此外，细胞培养稳定同位素标记联合iPOND（stable-isotope labelling by amino acids in cell culture- isolation of proteins on nascent DNA，SILAC-iPOND）和BrdU染色体免疫共沉淀（BrdU-ChIP）显示，在复制中的DNA上有至少两倍以上的MutSα结合（图1b-f）。研究者接着探索聚合酶突变所产生的复制错误被MMR系统识别后，是否会减慢复制从而进行修复。DNA纤维测定法显示，在P286R突变型细胞中，复制的速度不仅没有减慢，反而更快（图1g）。此外，通过shRNA敲低MSH6的表达后，对于突变型中较快的复制速度没有影响（图1h）证实MMR并不能调控由Pol ε介导的DNA复制的速度。

图1 MMR不能调控由Polε-P286R介导的DNA复制的速度

（图源：Zhang J, et al., PNAS, 2022）

升高的MutSα DNA结合水平不影响复制的速度，研究者随即探究其结合是否影响复制叉的稳定性。细胞用IdU和CldU两种dNTP的同源物进行标记，之后用羟基脲（hydroxyurea，HU）进行处理。在突变型的MEF和子宫内膜癌小鼠子宫内膜细胞中都呈现出复制叉降解的表型（图2c-e）。此外，shRNA介导的MSH6敲低和CRISPR介导的MSH2敲除都恢复了其表型（图2c-e）。说明在P286R突变型细胞中由于复制错误增加，募集的MutSα蛋白不能够完成修复，却促进了复制叉的降解。

图2 MutSα结合在DNA促进复制压力下的复制叉降解

（图源：Zhang J, et al., PNAS, 2022）

复制叉的降解在BRCA1缺陷型细胞中研究得非常详尽[8, 9]，通常由MRE11或DNA2等核酸酶介导。为探究MutSα介导的P286R细胞中的复制叉降解是否也是由MRE11介导，研究者使用MRE11抑制剂mirin处理细胞，并分析在HU处理下的P286R突变型细胞中DNA纤维比例，发现，mirin处理后即使在突变型细胞中也不再有复制叉降解的表型（图3a），而DNA2的抑制剂，以及敲除Exo1等核酸酶都未能逆转表型（图3c, 3d），表明MRE11是介导P286R细胞复制叉降解的主要核酸酶。

图3 MutSα促进的复制叉降解依赖于MRE11和RAD51

（图源：Zhang J, et al., PNAS, 2022）

研究者接着深入研究MutSα在复制DNA上的结合为何会导致复制叉的降解。与复制中DNA结合的蛋白通过iPOND（isolation of protein on nascent DNA）进行免疫沉淀，拉下来的蛋白通过质谱进行分析。通过比较Polε野生型和突变型之间的复制叉蛋白富集量差别，研究者发现许多与DNA修复通路有关的蛋白在突变型中低表达，尤其是FANCD2，BRCA1等蛋白（图4a）。FANCD2-BRCA1通路曾被报道在复制叉稳定性中起到重要作用[10, 11]，其中分子的缺失会导致细胞对复制压力敏感，停滞的复制叉被MRE11降解。为了验证MutSα介导的复制叉降解是否是通过同样的通路起作用，研究者进行了荧光共聚焦实验。在BrdU标记的复制中细胞中，FANCD2和MSH6呈现明显的拮抗效果。在突变型细胞中，由于MSH6的显著高募集，FANCD2的信号显著减弱；当MSH2敲除后，FANCD2的细胞核募集恢复到野生型水平（图4b-d）。表明MutSα的过度募集影响了FANCD2，BRCA1等复制叉保护蛋白的募集，从而促进了复制叉降解。

图4 MutSα与FANCD2等复制叉保护因子竞争性结合DNA导致复制叉降解

（图源：Zhang J, et al., PNAS, 2022）

由于停滞的复制叉降解会导致基因组不稳定，所以研究者检测了突变型细胞在复制压力下的单链断裂，双链断裂和染色体不稳定的水平。发现在突变型中，基因组不稳定水平显著上升（图5a-f）。

图5 MutSα促进复制叉降解导致基因组不稳定

（图源：Zhang J, et al., PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究首次报导DNA错配修复（MMR）与DNA复制的协作关系，与预期不同，MMR并不能调控复制的速度以进行修复。不仅如此，过多的MutSα在复制叉上的结合抑制了复制叉保护蛋白，FANCD2、BRCA1等的募集，从而导致复制叉易被核酸酶MRE11降解。该研究不仅在机制上发现MMR在聚合酶突变情况下的新功能，并且复制叉降解促进基因组不稳定，可联合肿瘤免疫疗法，为高突变型肿瘤的治疗提供了新思路。关于高突变型肿瘤对于复制压力与肿瘤免疫的敏感性需要进一步在小鼠体系内进行探究。此外，为何在高突变情况下，MutSα蛋白可以识别结合DNA复制错误，却没有完全修复，反而引起了复制叉的不稳定，需要进一步探究。特别是抑制FANCD2等蛋白结合的具体机制，是由于直接相互作用，还是占位效应或是其他情况，有待在单分子水平进行进一步的探索。
原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2201738119

通讯作者：Guo-Min Li（左）；第一作者：张君秋（右）

（照片提供自：Guo-Min Li实验室）

通讯作者简介

Dr. Li是德克萨斯大学西南医学中心教授，转化医学荣誉主席，在DNA错配修复领域深耕三十余年，研究涉及MMR的机制，及其在肿瘤、亨廷顿舞蹈症等疾病模型中的作用。往期文章精选优质科研培训课程推荐【1】单细胞测序与空间转录组学数据分析研讨会（10月29-30日 腾讯在线会议）【2】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会（2022年10月15-16日 腾讯会议）【3】临床预测模型构建与论文撰写：从入门到精通实战训练营（2022年10月4-7日，腾讯会议）【4】R语言临床预测生物医学统计专题培训（10月15-16日，北京·中科院遗传与发育生物学研究所）欢迎加入“岚翰生命科学” ”岚翰生命科学“ 诚聘副主编/编辑/运营岗位 (在线办公)
参考文献（上下滑动阅读） 

[1] S.A. Lujan, A.R. Clausen, A.B. Clark, H.K. MacAlpine, D.M. MacAlpine, E.P. Malc, P.A. Mieczkowski, A.B. Burkholder, D.C. Fargo, D.A. Gordenin, T.A. Kunkel, Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition, Genome Res 24(11) (2014) 1751-64.

[2] S.A. Lujan, J.S. Williams, Z.F. Pursell, A.A. Abdulovic-Cui, A.B. Clark, S.A. Nick McElhinny, T.A. Kunkel, Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity, PLoS Genet 8(10) (2012) e1003016.

[3] B.D. Harfe, S. Jinks-Robertson, Mismatch repair proteins and mitotic genome stability, Mutat Res 451(1-2) (2000) 151-67.

[4] S.A. Lujan, T.A. Kunkel, Stability across the Whole Nuclear Genome in the Presence and Absence of DNA Mismatch Repair, Cells 10(5) (2021).

[5] N. Constantin, L. Dzantiev, F.A. Kadyrov, P. Modrich, Human mismatch repair: reconstitution of a nick-directed bidirectional reaction, J Biol Chem 280(48) (2005) 39752-61.

[6] R. Li, S. Waga, G.J. Hannon, D. Beach, B. Stillman, Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication and repair, Nature 371(6497) (1994) 534-7.

[7] M.K. Shivji, S.J. Grey, U.P. Strausfeld, R.D. Wood, J.J. Blow, Cip1 inhibits DNA replication but not PCNA-dependent nucleotide excision-repair, Curr Biol 4(12) (1994) 1062-8.

[8] X. Lyu, K.H. Lei, P. Biak Sang, O. Shiva, M. Chastain, P. Chi, W. Chai, Human CST complex protects stalled replication forks by directly blocking MRE11 degradation of nascent-strand DNA, EMBO J 40(2) (2021) e103654.

[9] K. Schlacher, N. Christ, N. Siaud, A. Egashira, H. Wu, M. Jasin, Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11, Cell 145(4) (2011) 529-42.

[10] Y. Okamoto, M. Abe, A. Itaya, J. Tomida, M. Ishiai, A. Takaori-Kondo, M. Taoka, T. Isobe, M. Takata, FANCD2 protects genome stability by recruiting RNA processing enzymes to resolve R-loops during mild replication stress, FEBS J 286(1) (2019) 139-150.

[11] J. Michl, J. Zimmer, F.M. Buffa, U. McDermott, M. Tarsounas, FANCD2 limits replication stress and genome instability in cells lacking BRCA2, Nat Struct Mol Biol 23(8) (2016) 755-757.

本文完